Contichrom? CUBE層析系統(tǒng)可采用批處理和連續(xù)周期逆流（PCC）進(jìn)行目標(biāo)蛋白親和層析純化。PCC可使捕獲環(huán)節(jié)層析填料的利用率顯著提高，其與傳統(tǒng)批處理相比，可普遍提高40% - 60%。此外，還可使產(chǎn)量提高2倍。該系統(tǒng)具有更快的處理速度，可縮短目標(biāo)蛋白在上樣過(guò)程中與蛋白酶和糖苷酶的接觸時(shí)間，從而保護(hù)蛋白完整性。簡(jiǎn)化的雙柱位配置，最大限度地降低了硬件故障風(fēng)險(xiǎn)。2C-PCC (CaptureSMB?)是最簡(jiǎn)化和最有效的PCC設(shè)計(jì)。
本應(yīng)用手冊(cè)介紹了Contichrom? CUBE FPLC系統(tǒng)CaptureSMB?動(dòng)態(tài)過(guò)程控制——AutomAb?如何在層析填料結(jié)合載量發(fā)生變化的情況下進(jìn)行調(diào)整。層析填料結(jié)合載量的變化，是由于填料在使用過(guò)程中的損耗或上樣蛋白濃度不同、成分改變等造成的。該動(dòng)態(tài)控制是與FDA所提倡的通過(guò)過(guò)程分析技術(shù)（PAT）提高產(chǎn)品質(zhì)量相一致的。

產(chǎn)品介紹

連續(xù)流層析可獲得更高的產(chǎn)量，且成本更低，這是通過(guò)降低Protein A 填料用量和緩沖液消耗量實(shí)現(xiàn)的。由于操作穩(wěn)定，其可更好地保證產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。為保證連續(xù)工藝處于最佳設(shè)定點(diǎn)，需要進(jìn)行動(dòng)態(tài)過(guò)程控制。PCC工藝的高產(chǎn)量可使投入降低，設(shè)備占地面積更小，卻可提供與更大規(guī)格的普通設(shè)備相同的產(chǎn)出。

2C-PCC (CaptureSMB?)基礎(chǔ)理論

2C-PCC 僅用2根層析柱即可實(shí)現(xiàn)循環(huán)化捕獲純化過(guò)程（圖1），這是最簡(jiǎn)化和最穩(wěn)定的多柱捕獲過(guò)程，并已被科學(xué)證實(shí)，這比其它多柱配置更為有效。* 2C-PCC采用優(yōu)化的子過(guò)程進(jìn)行上樣、淋洗、在位清洗和再生，2根層析柱恰當(dāng)連接或獨(dú)立運(yùn)行。親和填料價(jià)格昂貴，通過(guò)優(yōu)化上樣工藝，可使親和填料達(dá)到完全滿載，利用率達(dá)到最高。

圖1. ?2C-PCC (CaptureSMBa)原理

步驟?1：在連續(xù)上樣階段，柱1和柱2保持串聯(lián)。柱1滿載樣品（紅色），其流穿被柱2捕獲。

步驟?2：柱1進(jìn)行洗脫、清洗和再平衡，同時(shí)柱2進(jìn)行連續(xù)上樣。

步驟?3： 柱1再生完畢后，將層析柱進(jìn)行串聯(lián)，柱2滿載后，其流穿被柱1捕獲。

步驟?4：柱2進(jìn)行洗脫、清洗和再平衡，同時(shí)柱1進(jìn)行連續(xù)上樣。該連續(xù)處理方法循環(huán)進(jìn)行。


圖2.普通層析和PCC載量利用率對(duì)比圖。圖A為批處理上樣。在批處理的捕獲過(guò)程中，當(dāng)樣品出現(xiàn)流穿時(shí)，上樣必須結(jié)束，從而避免樣品損失。圖B：在2C-PCC連續(xù)上樣階段，第1根層析柱進(jìn)行上樣，直至出現(xiàn)流穿（例如70%流穿），流穿樣品被第2根層析柱捕獲。因此，第1根層析柱的載量利用率得到顯著提高。

Contichrom? CUBE系統(tǒng)進(jìn)行2C-PCC

Contichrom? CUBE系統(tǒng)可進(jìn)行目標(biāo)分子的連續(xù)純化。其建立雙柱位Contichrom?平臺(tái)旨在簡(jiǎn)化系統(tǒng)配置和操作處理。其捕獲過(guò)程動(dòng)態(tài)控制功能AutomAb?是Contichrom? CUBE的關(guān)鍵功能。雙柱位設(shè)計(jì)不僅更可靠，而且比普通批處理和其它多柱位設(shè)計(jì)效率更高（圖3）。


圖3.載量利用率> 90%的多柱位系統(tǒng)產(chǎn)量對(duì)比圖。其顯示了典型上樣濃度2.5 g/L和5 g/L的影響結(jié)果。2C-PCC比普通批處理和更復(fù)雜的3柱位、4柱位設(shè)計(jì)更具優(yōu)勢(shì)。*

動(dòng)態(tài)過(guò)程控制原理

Contichrom? CUBE層析系統(tǒng)采用獨(dú)特的過(guò)程控制程序——AutomAb?自動(dòng)糾正過(guò)程中的偏差，從而使其保持在設(shè)定點(diǎn)。AutomAb?可以監(jiān)測(cè)并控制層析柱的飽和水平，且可以自動(dòng)進(jìn)行調(diào)整。如果工藝參數(shù)發(fā)生變化，比如樣品成分的變化（包括目標(biāo)蛋白質(zhì)量或濃度的變化）或?qū)游鎏盍陷d量的變化，上樣時(shí)間也會(huì)進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。層析填料的載量會(huì)由于親和配基的脫落而發(fā)生變化，例如用于mAb純化的Protein A。

該系統(tǒng)也可運(yùn)行固化的過(guò)程控制，即運(yùn)行預(yù)先設(shè)定的固定層析過(guò)程控制。無(wú)論該過(guò)程引入任何變化，都會(huì)被排斥掉，這將導(dǎo)致獲得的目標(biāo)產(chǎn)品的濃度和質(zhì)量發(fā)生改變。因此，當(dāng)進(jìn)行連續(xù)工藝生產(chǎn)時(shí)，動(dòng)態(tài)過(guò)程控制必不可少。

*參考文獻(xiàn): Baur D., Angarita M., Müller-Sp?th T., Steinebach F., Morbidelli M. 2016. Comparison of batch and continuous multi-column protein A capture processes by optimal design. Biotechnology Journal. 11: 1860-7314.

AutomAb? 控制的定義

AutomAb? 是一種保證捕獲過(guò)程處于最優(yōu)的控制工具，即使在過(guò)程參數(shù)發(fā)生變化時(shí)也不例外。當(dāng)2根層析柱串聯(lián)后上樣，第2根層析柱可以接收第1根層析柱的流穿(預(yù)上樣) 。AutomAb? 可以通過(guò)控制相關(guān)聯(lián)的上樣時(shí)間來(lái)保證預(yù)上樣面積恒定，從而保證在連續(xù)上樣過(guò)程中，上樣至下一根層析柱的樣品量保持相同。預(yù)上樣面積可由使用者自行確定，也可由AutomAb?在第1次循環(huán)中計(jì)算得到。

其它的動(dòng)態(tài)過(guò)程控制系統(tǒng)是通過(guò)測(cè)定柱前、柱后的UV 信號(hào)相對(duì)值來(lái)進(jìn)行判斷的，這需要1套額外的檢測(cè)器。然而AutomAb?僅需要1套UV檢測(cè)器位于2根層析柱之間即可（圖4）。因此，AutomAb? 消除了由于UV檢測(cè)器校準(zhǔn)偏差所造成的錯(cuò)誤風(fēng)險(xiǎn)。

圖4. 2C-PCC系統(tǒng)的每根層析柱都有其專(zhuān)屬的UV檢測(cè)器位于柱后。層析柱連接后，第1根層析柱的流出端UV信號(hào)，也同樣是第2根層析柱的流入端UV信號(hào)（見(jiàn)上圖UV1）。AutomAb? 監(jiān)測(cè)第1根層析柱的流出端UV信號(hào)并保證mAb持續(xù)上至第2根層析柱。

AutomAb? 控制操作

2C-PCC進(jìn)行多次循環(huán)操作后，層析柱載量會(huì)同單柱位捕獲一樣降低，例如填料的protein A配基密度降低導(dǎo)致。該影響通常可在重復(fù)清洗/淋洗以及堿處理后觀察到。其結(jié)果是，導(dǎo)致預(yù)上樣面積值縮小。同樣，蛋白濃度會(huì)隨時(shí)間增長(zhǎng)或降低（例如灌流細(xì)胞培養(yǎng)），從而導(dǎo)致預(yù)上樣到達(dá)時(shí)間提前或延遲。無(wú)論預(yù)上樣與之前的循環(huán)相比提前還是延遲，AutomAb?可以通過(guò)自動(dòng)調(diào)整上樣時(shí)間來(lái)保證預(yù)上樣面積恒定。因此，填料利用率和抗體回收率仍然保持在最優(yōu)水平。該控制系統(tǒng)還可以消除柱效差異所導(dǎo)致的不同流穿曲線形狀影響（圖5）。


圖5. AutomAb?控制的2C-PCC 圖譜。柱效差異所導(dǎo)致的流穿曲線形狀（紅線：柱1；藍(lán)線：柱2）并不影響預(yù)上樣。

增加控制的靈活性

與其它多柱位PCC相比，其連續(xù)上樣與回收、再生的執(zhí)行是完全獨(dú)立的，這避免了限速步驟（如長(zhǎng)時(shí)間CIP）與連續(xù)上樣并行進(jìn)行。因此，AutomAb?可徹底控制連續(xù)上樣時(shí)間。這保證連續(xù)上樣步驟在不同上樣濃度和載量降低的情況下，仍可在最大流速下進(jìn)行。

2C-PCC設(shè)計(jì)與 AutomAb?

使用CaptureSMB? 向?qū)В梢酝ㄟ^(guò)單次流穿曲線數(shù)據(jù)得到2C-PCC 運(yùn)行方法（見(jiàn)圖6）。該方法可顯示最優(yōu)的2C-PCC操作要點(diǎn)，該向?qū)Э娠@示預(yù)期的運(yùn)行狀態(tài)，例如產(chǎn)量、載量利用率、緩沖液和樣品消耗量、產(chǎn)品濃度以及運(yùn)行時(shí)間?？稍谙?qū)е羞x擇AutomAb?控制，當(dāng)運(yùn)行啟動(dòng)時(shí)該選擇即被激發(fā)，此后，AutomAb?即可保持最優(yōu)控制點(diǎn)。

圖6. CaptureSMB 向?qū)煞椒鞒虉D。AutomAb?控制為可選項(xiàng)。

結(jié) 論

毫無(wú)疑問(wèn)，連續(xù)流層析可顯著提高下游純化的產(chǎn)量。然而。若沒(méi)有動(dòng)態(tài)過(guò)程控制，則需要設(shè)定額外的安全范圍來(lái)避免洗脫產(chǎn)物發(fā)生變化，這將導(dǎo)致工藝缺乏可靠性或造成產(chǎn)品損失。

AutomAb?動(dòng)態(tài)控制功能可保證2C-PCC實(shí)現(xiàn)最優(yōu)操作。在各種情況下，例如樣品濃度或?qū)游鎏盍陷d量的變化，都是可以得到補(bǔ)償?shù)摹utomAb? 確保連續(xù)流層析可用于處理存在上樣成分變化的 灌流細(xì)胞培養(yǎng)。